Charakterisierung von Tunneling Nanotubes zwischen equinen mesenchymalen Stromazellen

Ihre vielseitigen Wirkungsmechanismen machen mesenchymale Stromazellen (MSCs) zu attraktiven Kandidaten für zellbasierte Therapien für zahlreiche Erkrankungen. Neben etablierten parakrinen Effekten können MSCs auch interzelluläre Transportmechanismen nutzen, namentlich Tunneling‑Nanotubes (TNTs), um auf Zielzellen einzuwirken. Erstmalls beschrieben in 2004, als de novo entstehende, hochsensitive nanotubuläre Verbindungen, die den Transfer von Vesikeln und Organellen zwischen Zellen vermitteln, wurde TNTs, seitdem ein breites Spektrum von Funktionen und eine erhebliche morphologische Vielfallt zugeschrieben. Da spezifische TNT Marker bislang unbekannt sind, bleiben morphologische und funktionelle Eigenschaften das Hauptkriterium für deren Identifikation. Dazu zählen Schwebelage über dem Substrat, die Präsenz von Aktin und Tubulin, sowie die Fähigkeit, direkte Kommunikation zwischen zwei oder mehr gleichen oder unterschiedlichen Zellen zu ermöglichen. Im Rahmen der regenerationsfördernden Wirkungsweisen von MSCs ist dabei insbesondere der Transfer von Mitochondrien durch TNTs von Bedeutung für ihre Schutzwirkung auf residente Zellen. Allerdings bleibt dieses Phänomen noch wenig erforscht und soll in dieser Arbeit näher beleuchtet werden. TNT-artige Strukturen in fixierten equinen MSC-Kulturen wurden mittels Konfokalmikroskopie untersucht, mit Immunfluoreszenzfärbung zum Nachweis der Präsenz von Aktin und Tubulin. Darüber hinaus wurde ein Regime zur Schädigung der Mitochondrien durch Zugabe von Rotenon und Antimycin etabliert, um weiterführende Ko-Kulturexperimente zum Mitochondrientransfer durch TNTs zwischen gesunden und geschädigten Zellen zu ermöglichen. Mitochondrien behandelter MSCs wurden mittels Transfektion mit GFP markiert (pLV-mitoGFP) und mit unbehandelten MSCs die mCherry-markierte Mitochondrien (mCherry-Mito-7) sowie BFP-markierte Zellmembranen (TagBFP2-CAAX) hatten, ko-kultiviert. Qualitativ bestätigte sich zunächst, dass TNT-artige interzelluläre Strukturen zwischen den MSCs ohne Substratkontakt verliefen und diese Aktin sowie Tubulin enthielten. Die Zugabe von 0.5 µM Rotenon und 0.5 µM Antimycin für 6 Stunden erwies sich im Seahorse Mito Stress Test als geeignet für eine zuverlässige Beeinträchtigung der mitochondrialen Funktion und wurde daher für die Manipulation der zu schädigenden MSC-Fraktion vor Ansetzen der Ko-Kulturen genutzt. Morphologische Veränderungen der Mitochondrien nach der Behandlung sollen zukünftig mit dem Operetta CLS High Content Analysesystem quantifizieret werden. Im Live-Cell-Imaging konnten Mitochondrien-Transfer-Ereignisse dokumentiert werden, einschließlich Transfer über TNT-artige Strukturen. Die bisherigen Ergebnisse liefern einen Proof-of-Principle bezüglich des Mitochondrientransfers über TNTs zwischen equinen MSCs. Darüber hinaus werden sie als Grundlage für mechanistische Untersuchungen zu TNT-Bildung und Mitochondrientransfer als Wirkmechanismus von MSCs bei verschiedenen Zelltypen dienen.