A lentiviral vector system based on simian immunodeficiency virus for gene transfer into brain cells.

Lentivirale Vektoren sind für den gentherapeutischen Einsatz bei neurologischen Erkrankungen sehr gut geeignet, da sie sowohl teilende als auch nichtteilende Zellen infizieren und durch ihre stabile Integration zu einer Langzeitexpression des heterologen Gens führen. Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung eines auf dem Simian Immunodeficiency Virus (SIV) basierenden Gentransfervektors, der das grün fluoreszierende Markergen eGFP unter Kontrolle des humanen CMV (Cytomegalievirus) Promotors enthält, hinsichtlich seiner Infektionseffizienz und des zellulären Tropismus in vivo im Gehirn von Mäusen. Nach Optimierung der Produktion viraler Partikel mittels transienter Transfektion (i) durch Austestung verschiedener Mengen an Plasmid DNA, (ii) durch den Vergleich verschiedener Transfektionsreagentien und (iii) durch den Einsatz von serumhaltigen und serumfreien Zellkulturmedien konnte die erfolgreiche Pseudotypisierung des Vektors mit Hüllproteinen des Vesikulären Stomatitis Virus (VSV), des amphotropen Murinen Leukämie Virus (MLV), des Lymphozytischen Choriomeningitis Virus (LCMV), des Ross River Virus (RRV) und des Rabies Virus (RV) gezeigt werden, wobei infektiöse Titer im Bereich von 107 gfu (green fluorescent units)/ml mit VSV Pseudotypen, 105 gfu/ml mit MLV, LCMV and RRV Pseudotypen und 104 gfu/ml mit RV Pseudotypen erreicht wurden. Der Vergleich verschiedener Titrationsmethoden ergab, daß die Aktivitätsmessung der reversen Transkriptase am besten für die Normalisierung unterschiedlicher viraler Präparationen geeignet war. Eine effiziente Aufkonzentrierung aller pseudotypisierten Vektoren mittels Ultrazentrifugation und Ultrafiltration konnte gezeigt werden, wobei die Erholungsrate der infektiösen Partikel im Durchschnitt zwischen 50 und 70 % lag. Der Neurotropismus der pseudotypisierten Vektoren wurde durch Infektion neuronaler und nichtneuronaler Zelllinien analysiert, wobei jene Vektoren, die das heterologen Hüllprotein des Rabies Virus trugen, eine erhöhte Infektionseffizienz neuronaler Zellinien aufwiesen. Um die Eignung des Vektors für den direkten Einsatz im Gehirn zu evaluieren, wurden Methoden für die stereotaktische Injektion aufkonzentrierter viraler Partikel in das Striatum von Mäusen mit anschließender histologischer und immunhistochemischer Analyse der infizierten Zellen entwickelt. Die stereotaktische Injektionen von VSV-G pseudotypisierten SIV Vektoren in das Striatum führte zu einer hohen Transduktionseffizienz, da eGFP exprimierende Zellen bis zu 1 mm entfernt von der Injektionsstelle gefunden wurden. Immunhistochemische Doppelfärbungen von eGFP positiven Zellen mit zelltypspezifischen Markern ergab, daß überwiegend gliale Zellen infiziert wurden. Durch die hohe Transduktionseffizienz und den Tropismus für gliale Zellen konnte die hervorragende Eignung auf SIV basierender lentiviraler Vektoren für den gentherapeutischen Einsatz im Gehirn gezeigt werden.