A CRISPR/Cas9 Toolbox to Analyze the Role of STAT Proteins in Metabolic Dysregulation in Anaplastic Large Cell Lymphoma.

Hintergrund: Der „Warburg Effekt“ beschreibt den Zusammenhang zwischen Tumorentstehung und gestörtem Zellstoffwechsel. Krebszellen durchlaufen auf dem Weg zur Malignität eine weitreichende metabolische Umprogrammierung. Diese Studie versucht, eine ALK-negative ALCL-Zelllinie zu etablieren, um die potenziellen Auswirkungen von „Signal Transducers and Activators of Transcription“ (STAT)-Proteinen auf die metabolische Dysregulation im anaplastisch-großzelligem Lymphom (ALCL), einem T-Zell Lymphom, zu untersuchen. Obwohl aktuelle Studien einen Zusammenhang zwischen STAT-Proteinen und metabolischer Regulation vermuten, sind die spezifischen Auswirkungen dieser Proteine auf den Aminosäurestoffwechsel in T-Zell Lymphomen noch unbekannt. Methoden: In dieser Studie wurde CRISPR/Cas9-vermittelte Genom-Editierung verwendet, um eine ALK-negative ALCL-Zelllinie (Mac2a) mit Knockouts der STAT1, STAT3, STAT5A, und STAT5B Gene zu etablieren. Um die erfolgreichen Knockouts der einzelnen STATs auf der Proteinebene zu bestätigen, wurden Western Blots durchgeführt. Außerdem wurden TIDE-Assays durchgeführt, um die Effizienz der individuellen guideRNAs, die auf die spezifischen STAT-Gene abzielen, zu untersuchen. Um eine Einschätzung über die Auswirkungen der genetischen Veränderungen durch das CRISPR/Cas9 Knockout von STAT1/3/5A/5B auf Zellwachstum und Apoptose zu erhalten, wurde ein Zelldichtetest durchgeführt. Ergebnisse/Diskussion: CRISPR/Cas9-vermittelte Knockouts der STAT-Gene STAT1, STAT3, STAT5A, und STAT5B wurden erfolgreich durchgeführt. Die Ergebnisse des TIDEAssays deuten auf eine hohe Allel-Rekombination (40-80%) der STAT-Gene hin, während die Western-Blot-Analyse eine Verminderung der STAT1, STAT5A und STAT5B Proteinexpression zeigte. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass STAT3 ein essenzielles Gen in ALCL ist und dass STAT3-Knockout-Zellen nicht überlebensfähig sind. Allerdings zeigte der Zelldichtetest keine signifikanten Veränderungen der Zellproliferation, was auf die Notwendigkeit weiterer Untersuchungen bezüglich der Auswirkungen der STAT-Knockouts auf das Zellüberleben hinweist.