Defining blank spots in the map:Deciphering BVDV (pestivirus) entry by targeted functional genomics

HintergrundPestiviren (Familie Flaviviridae) sind wirtschaftlich bedeutsame Pathogene von Paarhufern. Pestivirus A und B (BVDV-1 und BVDV-2) sind die Erreger der bovine Virusdiarrhö und verursachen persistierende Infektionen durch eine einzigartige Strategie, bei der es im Fötus zur Entwicklung einer Immuntoleranz kommt. Bisher sind nur wenige essenzielle Faktoren für den Entry von Pestiviren bekannt. Dadurch bleibt der genaue Mechanismus des Eindringen in die Zellen unklar. Forschungsfragen/Hypothesen/ZieleUnser Ziel ist es den Mechanismus des BVDV Entrys aufzuklären. Um Proteine, die im Entry von BVDV eine Rolle spielen könnten zu identifizieren, haben wir einen funktionellen genomics Screen, der Claudine, Tetraspanine und Disulfidisomerasen umfasste, durchgeführt. Zusätzlich haben wir die Transkriptome von MDBK und CRIB-1 Zellen (Pestivirus-resistenter BVDV Subklon) verglichen. Basierend auf diesen Vorarbeiten hypothetischeren wir dass:A) Claudine und Tetraspanine an der Aufnahme von BVDV durch die Zellen beteiligt sind.B) Disulfidisomerasen und zelluläre Protease die viralen Glykoproteine fusionskompetent machen. C) Ein plasmamembranständiger Rezeptor oder Signaltransduktor, dessen Expression in CRIB-1 Zellen vermindert ist, ursächlich an der Resistenz gegen BVDV beteiligt ist. Wir wollen neue Faktoren, die am Entry von BVDV beteiligt sind, in einem definierten in vitro System entdecken und ihre genaue Rolle im Entry Interaktom festlegen. Das Wissen um die wichtigen zellulären Faktoren des viralen Entrys wird helfen, Wirtszelltropismus und die Infektion von spezifischen Geweben wie der Plazenta zu erklären. Wichtige Mitglieder des Entry Interaktoms können als Grundlage der Generierung von resistenten Tieren dienen, die Entwicklung spezifischer Inhibitoren lenken und das Verständnis für Wirtsspezifität und das zoonotische Risiko erhöhen. Ansatz / MethodenWir werden einen komplementären Ansatz, bestehend aus der Identifizierung von Kandidaten durch fokussierte funktionelle genomics Screens und der Bestimmung der Funktion dieser Kandidaten verwenden. Knock-out Zellen von Kandidatengenen werden durch CRISPR/CAS9 erstellt werden und dazu dienen, den Effekt des Knock-outs auf die Effizienz des Entry von Pestiviren und den genauen Ort der Entryblockade zu bestimmen. Direkte Interaktionen von Kandidaten mit viralen Proteinen werden mittels Koimmunopräzipitation definiert werden. Originialität und InnovationBisher war die Untersuchung des pestiviralen Entrys zumeist auf die Identifizierung und Charakterisierung individueller Faktoren begrenzt. Um das Interaktom des pestiviralen Entry zu bestimmen werden wir einen systembiologischen Ansatz verwenden um den Effekt von vielen Faktoren auf den BVDV Entry in einem semiquantitativen Ansatz bestimmen zu können. Involvierte ForscherDie PI ist eine international anerkannte Expertin für die Molekularbiologie von Pestiviren. Sie besitzt ein breites technisches Repertoire das alles Bereiche des hier vorgestellten Projekts abdeckt. Sie wird durch Experten im Bereich von CRISPR/CAS9 vermittelten knock-out (Screens), Pestivirusbiologie und Biochemie unterstützt.

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