Untersuchung autochthoner und allochthoner Krebsarten heimischer Gewässer auf Pilzinfektionen, unter besonderer Berücksichtigung von Aphanomyces astaci, und Klassifizierung des Erregers mittels moderner molekularbiologischer Methoden
Kurzbezeichnung
Krebsarten in heimischen Gewässern
Projektleitung an der Vetmeduni
Einrichtung Vetmeduni
Art der Forschung
Angewandte Forschung
Laufzeit
01.01.2004
-
31.10.2006
Projektkategorie
Einzelprojekt
Abstract
Im vorliegenden Forschungsprojekt ist es gelungen, aus symptomlosen burgenländischen Signalkrebsen den Krebspesterreger A.astaci zu isolieren und molekularbiologisch zu definieren. In weiteren Studien wurde erstmals eine vollständig beschriebene Glykosyl-Hydrolase Familie 18, Klasse V - Chitinase des Oomyceten A.astaci (Gb04) mit Hilfe der 5`, 3`-RACE-PCR (rapid amplification of cDNA ends-PCR) aus der Gesamt-RNA isoliert und analysiert.
Aufgrund der für das Krankheitsgeschehen 'Krebspest' unverzichtbaren Funktion der Chitinase wurde dieses Gen als zentraler Schwerpunkt für die molekularbiologische Diagnostik herangezogen. In einem qPCR-Assay wurde auf Grundlage der Chitinase ein A. astaci - spezifisches Primerset mit Oligonukleotiden aus der ITS-Region in einer Duplex-Reaktion kombiniert und evaluiert. Mit Hilfe dieses Tests konnte der Erreger zweifelsfrei in Freilandproben aus verschiedenen Bundesländern, wie z.B: Salzburg, Kärnten und dem Burgenland, detektiert werden.
Auf Protein-Ebene wurde basierend auf einem Strukturmodell der katalytischen Domäne der Chitinase spezifisch gerichtete Antikörper produziert. Eingesetzt im Westernblot konnte das Enzym extrazellulär detektiert werden.
Weiters gelang die Isolierung und Charakterisierung zweier als N-Acetylhexosaminidasen fungierender extrazellulärer, chitinolytischer Enzyme von A. astaci. Sie sind hauptverantwortlich für die substratunabhängige, konstitutive chitinolytische Aktivität, welche auch als diagnostisches Kriterium für A. astaci herangezogen wird.
Das extrazelluläre chitinolytische Enzymsystem von A. astaci kann somit wie folgt beschrieben werden:
Chitinase dient zur Aufspaltung von Chitin in Dimere von N-Acetylglucosamin, während die endgültige Aufspaltung in Monomere durch die N-Acetylhexosaminidasen erfolgt.