Understanding and exploiting the ability of small mass chemical effectors to induce production of antimicrobial compounds in fungi.

Seid mehr als zwanzig Jahren finden für die Entd eckung neuer Antibiotika nur noch wenige Methoden im industriellen Maßstab Anwendung, wie das „ Screenen “ von synthetischen Stoffbibliotheken und von Kombinationsbibliotheken, sowie die chemische Veränderung von bereits bekannten antimikrobiellen Stoffen. Vereinzelt werden neu beschriebene Organismen, zum Beispiel aus der Tiefsee, isoliert und auf antimikrobielle Wirkung hin untersucht. Aber die stetig zunehmende Inzidenz von antibiotikaresistenten Keimen und die gleich zeitige Abnahme der Anzahl von neu entdeckten antimikrobiellen Stoffen zeigen, dass die mo mentan zum Einsatz kommenden Methoden zur Entdeckung neuer Antibiotika nicht ausreichend sind . So ist seit den späten 90er Jahren kein neues Antibiotikum mit neuem Wirkmechanismus mehr auf den Markt gekommen. Während der ersten Jahre der Antibiotikaforschung waren Pilze eine der ergiebigsten Quellen für neue natürliche antimikrobielle Stoffe. Laufende Programme zur Sequenzierung von Pilzgenomen zeigen eine große Anzahl von noch unbekannten Genen, die in die Biosynthese von sekundären Metaboliten involviert sein könnten. Es besteht die reele Chan ce, dass diese Cluster auch neue antimikrobielle Stoffe enthalten. Unter normalen Laborbedingungen sind diese neuen Gencluster still gelegt und werden nur durch ein komplexes Zusammenspiel aus biotischen und abiotischen Faktoren exprimiert. Das Stilllegen dieser Cluster wurde mit Chromati nveränderung in Verbindung gebracht. Deshalb konnten trotz jahrzehntelanger intensiver Antibiotik aforschung nur wenige solcher Stoffe entdeckt werden. In dieser Dissertation wurde nun ein „ Screen “ etabliert, der auf der Nutzung von kleinen chemischen Modulatoren (SCs), die auch als Chromatinmodulatoren fungieren können, beruht. Diese SCs können Chromatin-modifizierende Enzyme inhibieren und dadurch die Expression von „ kryptischen “ Sekundärmetabolit-Clustern auslösen. Der so etablierte "Screen" führte zur Identifizierung einiger Pilze, die nach SC Be handlung mögliche neue antimikrobielle Wirkung zeigten. Die Pilzextrakte wurden im ersten Sc hritt gegen einen Gram - positiven, einen Gram - negativen Keim und einen Pilz getestet. Die be nutzten SCs zeigten unterschiedliche Wirkung abhängig vom Pilz, Medium und eingesetzter Konzentration. In einem zweiten Schritt wurden die antimikrobiell aktiven Pilzextrakte, die hauptsächl ich bakteriostatische Wirkung zeigten, gegen eine größere Anzahl und Diversität von Keimen getestet, unter anderem gegen zwei Methicillin - resistente Staphylococcus aureus Stämme (MRSA), als auch zwei „extended spectrum ß Lactam“ Klebsiella pneumonia und Escherichia coli Isolate. Ausserdem wurden alle antimikrobiell aktiven Pilzextrakte auf ihre Zytotoxizität gegen zwei humane Zelllinien hin (Caco2 colorectal epithelial adenocarcinoma; HepG2 hepato cellular liver carcinoma) untersucht . Die Zytotoxizität reichte von geringer (5-20% toten Zellen) bis hin zu moderater Wirkung (40% toten Zellen). Um die Mechanismen der SCs besser zu verste hen wurden die Einflüsse von biotischen und abiotischen Faktoren auf die Wirkung der SCs untersucht. Dafür wurde ein gut beschriebener Pilz, Aspergillus clavatus , unter verschiedenen Bedingungen mit den SCs behandelt und die Auswirkung auf die Expression der für die Produktion von bekannten Metaboliten verantwortlichen Gene untersucht. Ebenso wurde die Auswirkung diverser Kulturmedien auf die Wirksamkeit der SC Behandlung getestet. Darin zeigte sich eine starke Abhängigkeit der Wirkung dieser SCs von biotischen und abiotischen Faktoren wie zum Beispiel pH Wert und Stickstoffquelle. Zusätzlich war der Effekt metabolitspezifisch und eine Abhängigkeit von der Inkubationszeit wurde erkennbar. Die SC Behandlung führte in manchen Fällen zu einer annähernd verdoppelten St eigerung der Produktion von sekundären Metaboliten wie Patulin und könnte somit in industriellen Produktionsstämmen zum Einsatz kommen. Weiters wurde ein Isolat, das anti mikrobielle Wirkung nur nach der Behandlung mit SCs zeigte, ausgewählt. Aus diesem Pilz, Doratomyces microsporus , wurden die antimikrobiellen Stoffe isoliert und anschließend identifiziert. Die Isolierung erfolgte mittels etablierter Aufreinigungsprotokolle und die chemischen Strukturen der Stoffe wurden bestimmt. In Summe konnten zehn antimikrobielle Soffe aus diesem Pilz identifiziert werden. Keiner der indentifizierten Stoffe war vollkomen neu, allerdings wurde das zyklische Dipeptid cyclo-(Prolin-Methionin) zum ersten Mal in einem Pilz gefunden. Die Isolier ung verschiedener Auxin verwandter phytotoxischer Stoffe lässt vermuten, dass der Pilz auch Pflanzen infizieren kann. Zusammengefasst kann die Arbeitshypothese bestätigt werden, dass die SC Behandlung die Produktion von sekundären Metaboliten in Pilzen steigern kann und somit gut für industrielle "Screening" – Verfahren, aber auch für biologische Grundlagenforschungsfragen geeignet ist.